如何设计引物(设计引物的方法步骤)

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寡核苷酸已成为商品，其合成成本低，因此每次检测评估多个正向和反向引物是可行的。我们建议每种类型有三个引物，从而形成九个引物组合。

艰难梭菌tcdB基因引物的筛选。

A.三个正向引物(CD1、3和5)和三个反向引物(CD2、4和6)由BeaconDesigner(PremierBiosoft)设计。

B.所有九种可能的引物组合用于重复扩增从艰难梭菌630(CP010905.2)提取的相同区域的染色体DNA，同时使用合适的NTC。

C.使用安捷伦的Brilliant III SYBR Green mastermix(目录号600882)进行扩增和溶出曲线条件。

d，使用CD1/2(绿色)和CD5/4(蓝色)进行扩增，分别记录最低和最高的Cqs。只有一个NTC记录的Cq为45。

E.最敏感和最不敏感引物组合之间的Cq范围是6.2。因此，优选的引物对是CD1/CD2。CD5/4是最不理想的引物组合。

图2显示了实验的结果，其中初步筛选了艰难梭菌tcdB基因(KC292190.1)的三个正向和三个反向引物，并评估了灵敏度(由定量周期(Cq)确定)和引物二聚体形成的可能性(由无模板对照(NTCs)的扩增确定)。

结果表明，引物序列的微小差异可对检测的灵敏度产生显著影响，其影响是70倍(高低Cq之差为6.19)。

尽管对于许多分析来说，引物的浓度可以变化很大而不会对PCR的性能产生明显影响，但是如果靶的拷贝数低或者为了提高特异性，优化引物的浓度是非常重要的。

在测试了大量的检测方法后，我们观察到最差引物浓度和最佳引物浓度之间的δδCqs变化很大，大约5倍估计是一个工作平均值，尽管它可以大得多。

我们没有看到一个引物组不能优化至少一点点(2倍)，但我们也看到几个引物组的优化产生了很大的差异，使灵敏度提高了100多倍。

因此，我们的建议是，作为验证任何新引物组的常规部分，这一额外步骤是值得的，除非确定靶将大量存在。

但是，虽然引物浓度的变化会对PCR结果产生显著影响，但引物浓度并不能成为PCR实验可能成败的主要原因。图3所示的结果证明了这一点。只要引物浓度保持在约200-400nM的通常范围内，灵敏度的差异将小于4倍。

图3 |引物浓度对qPCR测定的影响。

A.使用安捷伦的Brilliant III SYBR Green mastermix(目录号600882)和引物TCD-f:agagttggtagaaaggtggatttag和Tcd-R。抗艰难梭菌630(CP010905.2)的ACATACCACCAATTTCTTTTAATGC的tcdB毒素基因(HM062503.1)。引物SLPA-F:attatttttttttttttttttctaaattt和SLPA-r . cctgttttgctgcaactact针对艰难梭菌S层蛋白的SLPA基因(AB258978.1)，用于扩增从艰难梭菌630(CP010905.2)中提取的染色体DNA。

B.放大图和溶解曲线。如果F或R引物的最终浓度保持在100nM，则获得绿色图谱，这表明至少对于该引物组，100nM太低。

C、Cq和引物浓度之间的关系表明，200 nm和400nM的最终引物浓度之间几乎没有差异。

不建议将引物浓度降低到100nM以下，如图4a所示，一个引物的最终浓度为50nM，这导致检测灵敏度显著下降。

图4 |引物浓度对qPCR检测的明显影响。引物slpA-F和slpA-R针对艰难梭菌S层蛋白(AB258978.1)的slpA基因，用于扩增从艰难梭菌630(CP010905.2)中提取的染色体DNA。

A.使用安捷伦的Brilliant III SYBR Green mastermix(目录号600882)进行扩增和溶出曲线条件。

B.使用1 103个目标拷贝获得的放大图和溶出曲线(插图)。用50nM F引物的终浓度获得三个蓝色扩增图谱，分别用100 nm f引物和200nM F引物的终浓度获得绿色和棕色图谱。

C.用1 108个靶拷贝得到的放大图和溶出曲线(图解)。

不同靶浓度之间的d，Cqs用不同浓度的引物扩增。

有趣的是，与图3中的例子相比，对于该引物组，100 nM的最终浓度并没有导致灵敏度的显著降低。

这些结果还表明，选择太低的引物浓度会影响检测的线性。

图4b显示了当使用1×105倍的模板时，通过使用相同的引物浓度获得的结果。

对于除50nM以外的所有引物浓度，两个实验条件之间的预期δ CQ为13.3，差异要大得多(图4d)。

同样，结论是结果很大程度上取决于引物。如果目的是结合灵敏度和精确定量，仔细优化引物浓度将是非常重要的。

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