微流控系统分离CTCs方法及背景介绍

液体活检背景介绍近年来，肿瘤诊疗技术取得了很大进展，但癌症仍是人类死亡的主要原因。癌症转移是导致癌症患者死亡的重要因素。同时，转移的过程相对复杂，增加了癌症诊治的难度。因此，对于癌症而言，早期诊断、实时监测和准确预后至关重要。

目前，传统的活检方法存在成本高、取材困难、创伤大等问题，难以实现早期检查和早期治疗。随着生物技术、分子技术和纳米技术的发展，一系列新技术被应用于癌症的诊断和治疗。作为体外诊断的前沿领域，液体活检涵盖了无创取样，检测肿瘤或转移灶释放到血液中的循环肿瘤生物标志物(CTCs、外泌体和cNAs)，为监测肿瘤动态和个体化治疗提供了新的途径，吸引了人们的注意(图1)。

图1:癌症的形成(A)、转移(B)和循环肿瘤标志物的特征(C)

微流控技术的应用分析液体活检的背景介绍

1微流控技术概述

微流控技术是一种在微米水平上处理或操纵液体的技术手段，它集成了混合器、执行器、反应器、分离器、传感器等。以优化检测过程。涉及电子、机械、化学、物理、生物等多个学科，具有高通量、高灵敏度、样品分析时间短、样品量小、可控性强等优点。它广泛应用于现代分析化学、药学、细胞生物学和遗传学等许多研究领域。也正是基于上述优势，微流控技术为探索液体活检中循环肿瘤生物标志物的检测开辟了一条通道，为癌症的早期诊断和治疗提供了一种新的有效手段。

2应用分类介绍

1)循环肿瘤细胞(CTCs)的检测

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)是指从原发肿瘤或转移灶边缘脱落，进入癌症患者外周血液循环的肿瘤细胞。它们不仅携带肿瘤细胞的全基因组，而且存在于癌症病变早期的外周血液循环中。因此，CTCs被认为是癌症研究的重要对象，是癌症早期诊断和疗效评价的重要标志，可以实现对癌症发展和治疗效果的实时无创监测。

近年来，CTCs的分离纯化技术不断发展，但由于CTCs的肿瘤异质性和稀有性(每107-109个血细胞只有1-10个CTCs)，CTCs的分离纯化面临着巨大的挑战。微流控技术平台因其集成度高、设计灵活、材料通用性强、自动化程度高而被广泛应用于CTCs的分离纯化。

目前基于微流控技术分离CTC的方法大致可以分为两类：未标记技术和免疫亲和技术(图2)。前者是根据物理特性，如大小、密度、形状、变形能力、介电特性等来分离靶细胞，后者主要是利用靶细胞的生化特性，通过细胞表面特异性表达的蛋白质生物标志物来分离靶细胞(主要分为抗EpCAM阳性捕获法和抗CD45阴性富集法)(图2)。

图2:通过微流控系统分离CTC的方法

基于免疫磁珠的CTCs分离富集是最常用的方法，具有较高的灵敏度和特异性。美净医疗自主研发的基于微流控技术的CTCs检测平台CellRichTM，可以通过癌细胞表面抗原与磁珠偶联的抗体之间的相互作用，高效富集CTCs。当血液流经微流控装置时，其他血细胞在流体力学的作用下被分离，与免疫磁珠结合的细胞会在磁场的作用下偏转进入分离富集通道，从而达到分离捕获循环肿瘤细胞的目的。与传统的物理分离方法相比，该方法具有更高的回收和纯化程度(图3)。

菲古尔

循环外泌体是肿瘤细胞分泌的具有生物活性的囊泡，直径为20-300nm。不同来源的外来体含有独特的脂质、RNA、DNA和蛋白质，可以直接反映细胞的起源和进展。外来体广泛存在于人体体液中，并且丰度很高(每毫升血液中有109-1012个外来体)。因此，检测和分析肿瘤来源的外来体可以作为一种无创性的探索肿瘤来源和进展的手段，从而辅助肿瘤的早期诊断和指导治疗。

近年来，外来体作为肿瘤生物标志物，成为无创活检(液体活检)的研究热点。但外泌体分泌是一个动态过程，在体液中实时变化，在肿瘤治疗过程中存在稳定性问题。因此，精确分离和分析外来体仍然面临着巨大的挑战。与超速离心、密度梯度离心等传统的外来体分离技术相比，微流控技术在检测自动化、集成能力、耗时、产品完整性、纯度和回收率等方面具有很大优势，有利于外来体的下游分析和应用。

目前基于微流控技术分离纯化外来体的方法主要分为两大类：囊泡大小(20-300nm)和表面生物标志物(如EpCAM，CD9、CD63、CD81)，且各有特点。前者基于纳米多孔结构，可以快速高效地捕获外来体。但由于外泌体的大小范围在纳米级别，对技术要求较高，可能会受到饱和度的限制。基于后者的免疫亲和原理，建立的微流控系统有抗体修饰微通道或免疫磁珠法(图4)，高通量，高灵敏度。但外来体也具有类似CTCs的异质性，特异性生物标志物低表达的外来体捕获效率不高。

图4:基于免疫亲和原理分析外来体的微流控系统

此外，虽然对外来体的研究发展迅速，但与CTCs相比，市场上缺乏成熟的微流控检测系统。在液体活检领域，外来体的研究和应用还没有CTCs那么广泛和成熟。因此，为了更准确地定量和定性分析肿瘤外来体，深入探索外来体的物理和生物学特性，设计一种集多种功能于一体的新型微流控系统，对于外来体的分离和分析至关重要。

3) cNAs检测

循环核酸是指在血液循环系统中发现的DNA和RNA片段。CNAs可以通过无创手段获得，用于分析肿瘤的遗传信息和表观遗传信息。基因表达谱与肿瘤的发生发展密切相关。因此，cNAs作为液体活检的重要生物标志物，可用于癌症的早期诊断和疗效评价。

鉴于检测技术的不成熟，肿瘤标志物cNAs的临床应用受到限制。传统的核酸提取分析方法，如电泳结合荧光染色等，有一定的局限性，劳动强度大，成本高，分步操作容易造成样品损失。微流控系统集成了多项技术，一台设备可以依次进行样品制备、反应、分离、纯化、分析等多项操作，减少样品损失，提高样品纯度。

因此，新型微流控系统可以作为研究人员研究循环生物标志物的重要手段，也是未来检测肿瘤生物标志物的发展方向。但是，目前用于cNAs检测的微流控系统还存在一些问题需要解决：a)常规的核酸提取过程是分步完成的，不能保证核酸片段的完整性，容易导致分析错误。因此，有必要发展一种软、简单、快速的核酸提取方法，以充分发挥基因图谱分析和分子测序技术的强大功能。b)传统的微流控系统只是一个简单的分离系统，cNAs分析需要qPCR、数字PCR和测序平台等。然而，PCR方法有其固有的局限性，例如扩增误差、可重复性差和不同的扩增效率。

图5:用于分析CNA的微流控系统

此外，不同肿瘤中基因突变的一般情况远比我们想象的复杂，存在严重的肿瘤异质性，这使得通过分析cNAs来辅助癌症诊断和治疗变得更加困难。这就需要优化现有微流控系统的性能，结合基因特性开发更多高精度、高效率、高集成度的微流控系统，从而更好地服务于液体活检的临床应用。

结论3

液体活检作为一种新的非侵入性样本采集方法，为癌症的诊断和治疗提供了新的途径。微流控技术以其高集成度和强时空可操作性为液体活检提供了重要平台，引起了科学界和生物技术界的极大关注。

与此同时，在临床肿瘤诊疗的转化和应用中，肿瘤液体活检仍面临诸多挑战：

a)这三种肿瘤生物标志物的含量极其稀少，且存在肿瘤异质性，分离纯化非常困难。为了克服这一挑战，有必要开发一种充分利用肿瘤生物标志物的物理和生物学特性的微流控平台。

b)基于微流控分离纯化肿瘤生物标志物的高精度、全自动化系统大多处于科研阶段，尚未广泛应用于临床。

c)循环肿瘤生物标志物与微流控平台的关系有待改善。为了进一步推动灵敏度高、重复性好的微流控系统的发展，需要在各种癌症患者身上进行大量的临床试验。

d)我们对肿瘤生物学的了解仍处于初级阶段。随着各种循环肿瘤生物标志物在肿瘤形成和发展中作用的深入研究，一种更加强大有效的商业化微流控系统将应运而生。

相信在未来，微流控技术将在肿瘤液体活检和个体化诊疗领域发挥越来越重要的作用。

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